深度读2-3-1：肺炎链球菌体外转化实验的重大改变（必看）

今天读书内容：DNA是主要的遗传物质。

01对遗传物质的早期推测

早期人们没有意识到核酸能够作为遗传物质，这主要是因为人们对核酸的结构缺乏了解。

1871年 F. Miescher在脓细胞中分离得到了核酸并对其元素组成进行了分析。A. Kssel对核酸分子结构进行了相对系统的研究。A. Kssel的学生P. A. Levene在1929年提出：DNA由核苷酸构成，一个核苷酸包括一个嘌呤（或嘧啶）、一个核糖（或一个脱氧核糖）和一个磷酸基团。Levene指出每个DNA分子约1500道尔顿（这个数据表明Levene分析的是DNA片段），与四个不同碱基构成的核苷酸的分子量之和接近，Levene据此提出每个DNA分子由4种不同的核苷酸连接而成（见图示），即四核苷酸假说（tetranucleotide hypothesis）。如果每个DNA分子仅由四个核苷酸连接构成，那么就只能是小分子，这样也就无法提供充足的遗传信息。Levene在1938年修正了对DNA分子量的估计，新证据表明DNA是大分子，但是Levene认为DNA是四核苷酸组合而成的固定单元的重复，这样的结构显然也无法满足遗传信息多样性的要求。

P. A. Levene的四核苷酸假说（DNA中的固定单元），引自维基。

02肺炎链球菌的转化实验2.1艾弗里实验的背景

肺炎链球菌的转化实验包括：格里菲斯的实验（体内转化实验）和艾弗里等的实验（体外转化实验）。其中新教材对艾弗里的实验表述变动较大。

格里菲斯的体内转化实验表明：加热杀死的S型细菌（注意并不是沸水浴加热，过高的温度会导致DNA变性且难以恢复）中含有转化因子，能够将R型细菌转化为S型细菌。格里菲斯还进行了体外转化实验，但他的体外转化实验失败了。在格里菲斯（1928）和艾弗里（1944）之间，另一些科学家的体外转化实验获得了成功，但是此时体外转化实验所用的S型菌的粗提取液成分复杂，转化效率不高。

艾弗里在前人的基础上继续实验，其实验思路是：从S型细菌粗提取液中分离出“转化因子”；然后弄清转化因子的化学特性，确定它属于哪一类化学物质。简单来说就是实验分两大步骤：一、转化因子的纯化；二、纯化的转化因子的分析鉴定。

2.2艾弗里的实验——转化因子的纯化

这里需要先说明一点，纯化操作时去除某成分后需要进行转化测试。如果去除某成分后转化活性仍在，则说明去除该成分的操作能够纯化转化因子；如果去除某些成分后转化活性丧失，则说明去除该成分的操作不适用于转化因子的纯化。

艾弗里等先将加热杀死的细胞用生理盐水洗涤然后放在含去氧胆酸钠的生理盐水中，机械振荡并离心，取上清液并加入无水乙醇，随即出现丝状沉淀物，将沉淀物取出溶解在生理盐水中，制备得到加热杀死的S型细菌提取液。

用氯仿法去除S型细菌提取液中的蛋白质，再用酶解法去除荚膜多糖。随后向其中加入乙醇，立即出现丝状沉淀物，再将丝状物溶于生理盐水中。

注：上述操作就是将细胞破碎释放出DNA，然后去除杂质并利用DNA不溶于酒精的特性来制备DNA。需要明确的是艾弗里并不是有意识地提取DNA，当时也没有成熟的分离提纯生物体内DNA的方法，他只是关心转化因子的纯化。

2.3艾弗里的实验——转化因子的分析鉴定

定性分析：双缩脲试剂检测无反应，二苯胺试剂（检测DNA的试剂）检测有反应。

化学元素分析：N/P比与四核苷酸假说推算的DNA中的N/P一致（艾弗里实验时四核苷酸假说还被认为是正确的）。

酶学分析是教材重点介绍的内容，这里不再重述。需要说明的是，1944年并没有纯的DNA酶可用，艾弗里等人用狗的肠黏液、肺炎链球菌自溶物以及狗和兔子血清（已知上述成分中含有使DNA解聚的酶）处理转化因子，然后进行转化测试，结果显示转化活性丧失。考虑到上述材料并不纯，因此最初的实验说服力是打了折扣的。1946年艾弗里等人从别的研究小组处得到了纯化的DNA酶，测试表明：（纯的）DNA酶能够使纯化的转化因子失去活性。

物理化学分析：电泳、离心和紫外光吸收分析表明，纯化的转化因子纯度高，各方面的表现和已知的DNA一致。

生物学活性的测定：制备的纯化转化因子即使稀释上万倍，仍然具有转化能力。

对纯化的转化因子的分析和鉴定表明：转化因子是DNA。

2.4怎样理解艾弗里的实验

新教材对艾弗里实验的表述更贴近原始实验。

“20世纪40年代，艾弗里和他的同事将加热杀死的S型细菌破碎后，设法去除绝大部分糖类、蛋白质和脂质，制成细胞提取物。”——这是介绍化因子的纯化操作。

教材随后介绍了纯化的转化因子的分析与鉴定，花了大量篇幅（主要是配图和文字）处理酶学分析与鉴定，这主要是考虑到学生容易理解，也便于本节后面介绍“减法原理”。师生们要注意，酶学分析只是纯化的转化因子分析鉴定的一部分，教材还同时指出：“进一步分析了细胞提取物的理化特性，发现这些特性都与DNA的极为相似”，于是艾弗里提出：DNA是转化因子。

2.5转化是怎样发生的？

转化的实质是同源重组（基因重组的一种）。

在培养过程中部分R型细菌处于“感受态”，处于的感受态的R细菌能相对高效地摄出外源DNA片段。如果加热杀死的S型细菌的DNA刚好被R细菌摄取，就可能发生同源重组，使R型细菌转化为S细菌。

03噬菌体侵染细菌的实验3.1噬菌体侵染细菌实验数据粗糙

注：T2噬菌体中的“2”不是下标。另外，有些噬菌体的遗传物质是RNA，授课时不能将T2噬菌体等同于所有噬菌体。

原教材认为T2噬菌体侵染细菌的实验比艾弗里的实验更有说服力，这主要是考虑到噬菌体小组在生物学中的统治地位（如沃森和赫尔希都是噬菌体小组的核心成员）。

赫尔希和蔡斯在1951年和1952年各发了一篇噬菌体侵染细菌实验的论文，1951年他们的结论是：³⁵S从亲代噬菌体传递到了子代噬菌体——1952年他们就否定了自己，这说明实验本身有难度，否则也不会造成前后矛盾的情况。

本实验特别关键的部分就是对上清液和沉淀进行分析。但是论文作者指出：在离心过程中得到的所有沉淀都未经洗涤，因此含有5%的上清液。

赫尔希和蔡斯在论文中同时提出几个他们没有解决的问题：

1、除了DNA外，还有其他种类的不含硫的噬菌体物质进入细胞吗？

2、假定有的话，那么它能传递给子代噬菌体吗？

3、磷（也许还有其他物质）传递给子代是直接的，还是间接的？

3.2放射性标记的问题

在T2噬菌体中含³⁵S的物质＝蛋白质，这没太大的疑义；但是含³²P的物质＝DNA则是有问题的。教材旁栏的信息中提到：磷几乎都存在于DNA分子中，也就是说蛋白质中也含有少量的磷。考虑到遗传物质的量并不多，少量含P的蛋白质（同时缺乏³⁵S）也可能充当了遗传物质。虽然这个不靠谱的推测可以通过赫尔希和蔡斯原文数据加以排除（亲代噬菌体中的³²P传递到子代可达到30%甚至更多），但对于学生而言，排除这一可能性还是比较困难的。

3.3噬菌体侵染细菌的个人教学处理

我用假说演绎法处理赫尔希和蔡斯的实验。

实验预备知识：

T2噬菌体含有蛋白质和DNA；T2噬菌体能够侵染大肠杆菌，并且侵染和增殖所需的时间是前期研究已经确定的。

注：教学中不能在教学开始就播放T2噬菌体侵染细胞的动画。噬菌体侵染过程是在赫尔希等研究的基础上推断出来的，提前把侵染过程讲了，该实验就失去了分析的意义和价值。

实验思路分析：

噬菌体的遗传物质不能在大肠杆菌体外遥控子代噬菌体的产生，它必须进入到大肠杆菌体内以指导子代噬菌体的合成。

注：进入大肠杆菌体内只是作为遗传物质的必要条件，而不是充要条件。也就是说，进入大肠杆菌的物质不一定是遗传物质，但是作为遗传物质一定要进入大肠杆菌体内。

噬菌体侵染大肠杆菌时，并不是整体进入大肠杆菌体内，但它需要将遗传物质注入大肠杆菌体内，只要将“失去遗传物质的噬菌体”和“注入了噬菌体遗传物质的大肠杆菌”分开来进行分析，就能获得更多可供分析的信息。

实验步骤：

分别培养获得³²P或³⁵S标记的噬菌体，然后用标记的噬菌体侵染大肠杆菌，控制时间保证噬菌体足以将遗传物质注入大肠杆菌体内，但又不至于导致大肠杆菌裂解释放出子代噬菌体。随后搅拌离心，得到上清液（主要是失去了遗传物质的噬菌体）和沉淀（主要是被侵染的大肠杆菌），然后分别检测上清液和沉淀的放射性。

实验结果分析（假说演绎法）：

实验结果支持DNA是遗传物质，不支持蛋白质是遗传物质。

4.4亲子代噬菌体具有连续性的分析

培养得到子代噬菌体并进行分析，发现³²P在亲子代噬菌体之间具有连续性，但是³⁵S不具有，这也支持DNA是遗传物质。

通常认为³²P在亲子代具有连续性能够说明DNA是遗传物质。我个人认为：这种连续性用DNA是遗传物质来解释相对合理，但并不是唯一合理的解释。

³²P进入噬菌体，说明含³²P的物质可能是遗传物质，也可能含³²P的物质作为侵染必需成分进入大肠杆菌体内，并在随后作为合成子代噬菌体的原料，而不一定是作为遗传物质。举一个不恰当的例子，HIV侵染时，逆转录酶也进入了宿主细胞中；最初的逆转录酶可被降解为氨基酸，参与子代HIV蛋白质的合成，这并不能说明逆转录酶就是遗传物质。同样的例子中，亲代HIV的RNA会被降解，子代RNA主要是利用宿主的原料重新合成的，亲子代的遗传物质也不具有必然的连续性。

噬菌体侵染细菌实验由许多内容组成，多方面的证据都支持DNA是遗传物质。只依据单方面的证据分析得出确定性的结论是不严谨的，也不是科学应有的态度。科学史内容编入教科书时，需要综合考虑教学目的、学生的思维特点、教科书的篇幅等因素，一般只选择了最有说服力的内容呈现。